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drug screening method.  <고아  GPCR  리간드 screening >

G protein : 역할
1. 감각 : 후각-400종, 시각-3종,  미각-30여종
2. 신경전달, Cannabinoid
3. chemokine receptors : 면역, 염증
4. 자율 신경 : 혈압, 심장박동, 소화, 포만감
5. 세포농도
6. 항상성 조절 (e.g., water balance)
7. 신약 개발

고아 GPCR 스크리닝법에 있어서 첫번째 수행되어야 할 일은 GPCR 전장유전자 (full-lengthgene)을 진핵세포 발현벡터에 도입하는 것이다. 주로 사용되는 진핵세포는 포유류 세포, 제노푸스 난자, 혹은 제노푸스 melanophore 이다. 세포주를 사용할 때 가장 중요한 사항은 그 세포주에 도입하고자 하는 GPCR 유전자가 존재하지 않아야 한다. 이러한 관점에서 제노푸스 난자는 고아 GPCR 발현에 좋은 조건을 가지고 있다.
하지만 제노푸스 시스템은 고속 리간드 스크리닝에는 적합하지 않은 단점이 있다. 따라서 포유류 세포인 HEK293나 Chinese hamster ovary (CHO) 세포주가 자주 사용되는데, 이 세포주들은 다양한 G 단백질 repertoire를 가지고 있어 GPCR이 활성 되었을 때 그 하위단계 신호전달 측정이 용이한 장점이 있다. 하지만 각 GPCR들은 고유의 신호전달 체계를 갖추고 있기 때문에 다양한 세포주들을 사용해 보는 것이 권장된다. 신호전달활성에 대한 측정은 주로 2차 전달자 즉 cAMP, IP3, or Ca2+ 의 변화를 관찰하는 방법으로 이루어 지나 세포의 대사를 측정하는 cytosensor microphysiometer 방법도 사용된다. 모든 신호전달시스템은 에너지를 사용하게 되어 있어. Cytosensor microphysiometer assay 방법은 GPCR이 활성화 될 때 세포바깥의 배양액의 pH 변화가 발생한다는데 착안하고 있다. 따라서 이러한 방법은 세포신호전달 특이성으로 발생할 수 있는 문제를 피할 수 있는 장점이 있으나 측정방법의 특성상 고속 리간드 스크리닝에는 불리한 점이 있다. 이러한 방법을 이용하여 APJ 및 RF-amide peptides에 대한 고아 GPCR 리간드 발굴에 이용되었다. 제노푸스 난자를 이용하는 방법은 GPCR이 제노푸스 난자에 내재적으로 존재하는 Gi/o를 활성화시켰을 때 Cl- 전류흐름이 관찰된다는데 착안하고 있다. 즉 제노푸스 난자에 고아 GPCR mRNA를 도입하고 전압을 고정한 다음 여러 리간드 소스를 투여하고 사용하여 전류의 흐름 측정하게 된다. 이러한 방법을 이용하여 CysLT1 고아 GPCR의 내재적인 리간드로 LTD4를 밝힐 수 있었다 .
제노푸스 멜라노포어는 다량의 멜라닌 색소를 가지고 있는 melanosome을 가지고 있으며 이 기관에서 멜라닌 색소의 분산은 GPCR 신호전달에 의존적이다. PLC나 AC의 활성은 색소의 멜라닌 색소의 분산을 유도하여 세포의 색갈이 어두어진다. 하지만이 세포에 유전자 도입이 용이하지 않은 문제를 가진다 . 최근에 개발된 Ca2+ 이미지 측정법은 GPCR 리간드 고속 스크리닝을 가능하게 하였다. 형광현미경에 CCD 카메라를 연결하여, 96-well이나 384-well에 있는 세포에서 발생하는 Ca2+ 이미지를 측정하는데, 이때 사용하는 장비를 Fluorescence Imaging Plate Reader 라 한다. 이러한 방법은 Gq/11, PLC 활성에 따른 세포 내 Ca2+ 의 증가를 측정하는 것으로 민감성이 매우 높은 장점을 가지고 있다.
또한 키메라 G 단백질을 세포 내에 도입하여 다양한 G 단백질로부터 내려오는 신호 측정이 가능하다. 또 다른 고속스크리닝 법으로 단백질이동 형광측정법 (Fluorescence-based protein translocation assay)이 있다. b-arrestin2이 세포질에 있다가 GPCR이 활성화 되었을 때 세포막으로 이동하는 특성을 이용하여 b-arrestin2에 형광물질을 붙인 융합단백질을 제작하고 이들의 움직임을 형광현미경으로 분석하는 것이다 . 하지만 수용체의 활성이 약할 경우 b-arrestin2 이동이 잘 관측되지 않을 수 있으며, 모든 GPCR이 b-arrestin2와 결합하는 것은 아닐 뿐만 아니라 또한 Ca2+ 이미지 측정법과 마찬가지로, 이 방법은 inverse agonist나 antagonist 분석은 용이하지 않은 단점이 있다.
이러한 여러 가지 스크리닝 방법들의 단점을 극복하고자 최근에 2차 신호전달자를 매개한 유전자 발현 분석시스템을 사용한 스크리닝 시스템이 개발되었다. 이 시스템은 2차 신호전달자에 의해 조절되는cAMP responsive element (CRE) 혹은 serum responsive element (SRE)를 포함하는 프로모터와 루시퍼레이즈 (luciferase) 유전자를 융합한 표지벡터를 사용한다. 이와 같은 신호전달 특이적 유전자 발현시스템을 사용하면 리간드 의존적 활성 및 리간드 비의존적인 constitutive 활성도 측정되기 때문에 inverse agonist 스크리닝도 가능하다.
서로 다른 G 단백질에 의해 활성화 되었더라도 유전자 발현수준에서는 중첩되는 경향이 있어 다양한 신호전달을 측정할 수 있는 장점이 있다 . 또한 96-well이나, 384-well 시스템에서 측정이 가능하기 때문에 고속 스크리닝에도 적합하다.