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산응고 : 단백질 등전점

단백질 구조 변화(변성) 원인 : 단백질응고 사례
- 단백질 열응고
- 화학적 응고(2가 이온) : 칼슘, 마그네슘
- 기계적 변성 : 아이스크림 휘핑
- 등전점 : 산응고

산응고
- 치즈 응고
- 두부 GDL
- 사후강직
- 단백질 내산성


용해도
- 유유상종 : 극성끼리 비극성끼리
- 반발력 : Na,K 처리, 등전점
- pH와 용해도




 


 

콩단백질 등전점 과 용해도

 


등전점 = charge 0 = 반발력 제로 = 용해도 가장 낮음

 


두부·빵의 비타민C에 의한 활성산소 발생과 품질개량 기작
한국과학기술정보연구원 전 문 연 구 위 원 최 영 욱

1. 서론
○ 많은 연구에서 비타민 C(L-ascorbic acid, 이하 AsA)의 빵 품질개량 효과에 관한 메커니즘이 보고되었고, 어묵에서도 어육의 연육에 산화형 비타민 C(dehydro-L-ascorbic acid, 이하 DHA)을 첨가하면 어묵의 품질개량이 동일 기작에 의해 품질개량이 되는 것으로 간주되어 왔다.
○ 그러나 Nishimura 등은 과산화물 음이온 라디칼(O⁻₂)이 관여하는 기작에서 어묵의 품질개량 효과를 밝혔고, AsA는 미오신 후미보다 두부에 작용하기 쉬운 사실도 확인하여 새로운 AsA의 품질개량 기작으로 발표하였다. 본고에서는 AsA의 품질개량 기작이 어묵(근육섬유 단백질)뿐만 아니라 두부(콩 단백질), 빵(밀 단백질)에서도 성립할 수 있는 가능성에 대해서 해설한다.

2. 콩 단백질에서 AsA의 11S globulin에 대한 효과
○ 콩 단백질은 4가지 주요 단백질 즉 2S, 7S, 11S, 15S 글로불린으로 나눈다. 7S, 11S 글로불린은 단백질 간 SS결합(disulfide bridge)을 형성 할 때 단백질의 불용성, 탁도와 점도가 상승한다. 가열에 의한 겔 형성에서는 겔 형성 시 분자 간 SS결합이 중요한 역할을 담당하는 것이 밝혀졌다.
○ 11S 글로불린은 시스테인 량이 7S보다 많고, 11S의 SH기의 쪽이 7S보다 반응성이 풍부하므로 11S 글로불린이 SS결합 중합체 형성에 더 많이 관여하는 것이 판명되었다. 따라서 대두 단백질로서 11S 글로불린을 선택하여 가열 겔 형성에 대한 AsA의 품질개량효과를 검토하였다.

○ 환원형 11S 글로불린 용액(단백질 농도 44.1±0.7mg/mL(n=3), SH기량moles/mL(n=3))을 조제하여 80℃ 가열 중 AsA 첨가효과를 SDS-Polyacrylamide gel 전기영동(PAGE)법에 의해 추적하였다. AsA무첨가 환원형 11S 글로불린 용액에서는 80℃ 가열 60분후까지 그 단백질에 큰 변화는 보이지 않았지만, 120분 후에 농축 겔에도 들어갈 수없는 거대분자량응집체 형성이 관찰되었다.
○ 한편 0.2% AsA를 함유한 환원형 11S 글로불린 용액에서는 가열 30분후부터 거대분자량의 응집체 형성이 나타나 그 양이 증가하였고, 산성및 염기성 서브유닛의 양의 감소가 관찰되었다. 이들 거대응집체는2-mercaptoethanol 첨가로서 소멸하고, 산성 및 염기성 서브유닛 양의 회복이 나타났다. 이는 거대응집체가 SS결합 중합체 형성을 촉진하는 것을 나타내고 있다.
○ 80℃ 가열 중 AsA 효과가 확인된 것은 이 11S 글로불린에서의 품질개량 효과는 효소가 관여하는 기작에서 생기는 것을 부정하는 것이다. 왜냐하면 80℃ 아래에서는 많은 효소가 가열실활 가열 실활 때문이다. 따라서 11S 글로불린에 대한 AsA의 품질개량 효과는 [O⁻₂가 근육단백질인 미오신중쇄(Myosin Heavy Chain; MHC)의 SH기의 H·를 뽑아내어 S·을 생성하면 래디컬 산화에 의해 MHC간 SS결합이 완성되는 기작]에서 생길 가능성이 크다.
○ MHC간 SS결합이 완성되는 기구에서 생성되는 것이라면 11S 글로불린에서도 thiyl 라디칼(S·)의 발생은 관찰되어야 하는 것이다. 그래서 이어서 전자스핀공명법(ESR; lectron spin resonance)법을 이용하여 검토하였다. 그러나 O⁻₂발생원으로서 사용된 AsA는 환원력이 강하고,ESR 측정에서는 mono dehydro-L-ascorbic acid 라디칼의 시그널밖에
얻지 못했다.
○ 따라서 광 조사에 의한 AsA와 같은 O⁻₂를 발생하는 리보플라빈(Rf)을 사용하여 11S 글로불린에서 O⁻₂에 의해 S·가 발생하는가에 대한 검토에서 AsA에 의한 SS결합 중합체 형성촉진 효과가 나타났다.

3. 농축환원 11S 글로불린 용액 중 AsA에 의한 O⁻₂의 발생
○ 실제로 AsA 첨가에 의해 농축환원 11S 글로불린 용액에서 O⁻₂가 발생하는가를 검토하였다. O⁻₂에 의해 발색하는 nitroblue tetrazolium(NBT)를 0.5mM 함유하는 농축환원 11S 글로불린 용액(맹검), 여기에 AsA를 0.01%가 되도록 첨가한 용액, O⁻₂의 스카벤저인 tiron을 20mM이 되도록 첨가한 용액을 80℃ 1분간 인큐베이션 했을때의 미가열 및 가열 후의 색 변화를 관찰하였다.
- 그 결과 미가열의 맹검, AsA 첨가 및 AsA·tiron 첨가 농축환원 11S글로불린 용액 사이에 큰 색깔의 차이는 없었다. 그러나, 80℃ 1분 가열하면 맹검은 인큐베이션 전과 색의 변화는 전혀 나타나지 않았지만AsA 첨가용액에서는 강한 빨간색 나타났다. 이 발색은 O⁻₂의 스카벤저인 tiron을 첨가함으로써 억제되었으므로, 11S 글로불린 용액 중에서 AsA에 의해 O⁻₂가 발생하는 것을 나타내었다.

4. 빵 반죽에서 AsA에 의한 O⁻₂의 발생
○ 실제로 AsA에 의해 빵 반죽에서 활성산소가 생길 가능성에 대한 조사는 소맥분(강력분)에 NBT 1mM이 되도록 첨가하여 빵 제조 공정 중 O⁻₂ 발생 여부를 검토하였다. NBT만 첨가한 반죽(맹검), 여기에 AsA를 0.01% 첨가한 반죽, 다시 여기에 tiron을 9.7mM이 되도록 첨가한 반죽 등 3가지를 비교하였다.
- 그 결과, , , 각 반죽의 조제 직후에는 큰 차이가 없었다 그러나, 30℃ 30분간 인큐베이션하면 맹검 반죽에서는 색 변화가 없었고, 에서는 강한 빨간색이 되었으나, 에서는 그 발색은 O⁻₂의 스카벤저인 tiron에 의해 억제되었다.
○ 이로써 AsA에 의해 반죽 중에서도 O⁻₂가 발생되는 것이 판명되었다.

즉 반죽에서도 O⁻₂에 의해 글루텐에 S· 발생이 확인되면 빵에서도 품질개량 기구가 생긴 것을 증명된 것이다. 또한 AsA대신 리보플라빈(Rf)를 빵에 사용하여 O⁻₂가 발생하는가에 대한 검토에서도 동일한결과가 나타났다. 이는 AsA 대신에 Rf을 O⁻ 발생원으로 빵 반죽에서도 사용할 수 있다는 것이다.

5. 효소반응에 의한 글루테닌의 가용화
○ AsA의 품질개량 효과를 증명하기 위하여 ESR법에서 O⁻₂에 의한 글루테닌 상에 S· 발생을 검출하지 않으면 안된다. ESR 측정을 위해서는 가용성 시료가 아니면 측정이 곤란하므로 protein glutaminase를 사용하여 탈아미노화하여 가용화시킨 다음 SDS-PAGE법으로 조사하였다.
○ 그 결과, 조제한 글루테닌에는 소맥분 단백질에 비해 분자량 130,00에서 37,000의 글루테닌의 주요 단백질을 중심으로 한 진한 색의 밴드가 관찰되었다. 가용화 한 것은 분자량 160,000 근처에서 글루테닌에서는 나타나지 않았던 밴드가 출현하였다. 이는 글루테닌을 탈아미노화함으로써 고분자량그대로 가용화되는 것을 나타낸 것이다.

6. 글루테닌 S·의 검출
○ Rf에 광 조사(520,000lx)함으로써 O⁻₂를 발생시켜 가용화 글루테닌 상에 S·가 발생하는가를 검토하였다. 광 조사 전의 SS환원 가용화 글루테닌에서는 시그널은 나타나지 않았다. 그기에 광 조사(520,000lx)하였더니 시그널이 나타났다. 결합 중합체 형성촉진 효과가 나타났다.
○ 한편 n-ethylmaleimide(NEM)을 사용하여 SH기를 블록(block)시킨 NEM처리 가용화 글루테닌을 사용하여 동일 시그널이 유별나게 작아졌다. 이는 SS환원가용화 글루테닌에 함유된 SH기량에 의존하여 발생된 것이므로 광 조사 후 시그널에는 S·가 포함된 것으로 볼 수 있다.
○ 앞서 <11S 글로불린 용액에서 O⁻₂발생> 항에서 기술한 바와 같이 Rf에서는 O⁻₂뿐만 아니고 OH·도 발생한다. 이 OH·의 관여를 검토하기 위해 SS환원가용화 글루테닌에서 과산화수소의 스카벤저인 catalase(3,333 units/mL)을 함유한 시료와 가열 실활된 catalase를 동일 량으로함유하는 시료를 ESR로서 측정하였다. 그 결과 카탈라제를 함유한 시
료도 광조사 후 시그널과거의 같은 시그널 파형과 강도가 나타났다. 이로부터 SS환원 가용화 글루테닌 상의 S·발생에는 OH·가 관여하지 않는 것을 시사하고 있다.
○ 이상과 같이 빵에 있어서도 AsA에 의한 품질개량 효과 Fe⁺⁺⁺은 AsA의 자동산화를 촉매하는 기작 즉 MHA의 O⁻₂의존형 중합화 기작에의해 생기는 것을 나타낸 것이다.

7. 결론
○ AsA에 의한 두부(콩 단백질)와 빵(밀 단백질)에서 품질개량 효과로서
O⁻₂가 관여하는 기작이 성립되는 것으로 나타났다. 어묵(근육섬유 단백질)에서도 본 기작이 AsA의 품질개량 효과로서 나탔다. 즉, 발효식품이 아닌 어묵이나 두부 등의 SS결합에 의한 단백질 겔상 식품에서는 효소가 개입하는 기작을 따르지 않고, O⁻₂가 관여한 기작에 의해 개량효과가 나타나는 것으로 판단할 수 있다.
○ 빵에서는 양 기작이 존재하여 제조과정의 상황에 따라서 우위를 차지하는 품질개량기작이 다른 것으로 추정할 수 있다. 즉, 용존산소가 발생하는 O⁻₂가 필요하게 되므로 발효가 일어나지 않는 찐빵과 같은 무발효 빵이나 이스트를 사용한 발효 빵에서도 충분하게 발효가 일어나지 않는 단계(용존산소가 충분히 존재한 단계)에서는 O⁻₂가 관여한 기작에서 AsA의 품질개량이 일어날 것이다.
○ 발효가 진행됨에 따라 용존산소의 고갈이 일어나면 산소가 개입하는 기작이 우위를 차지하여 가기 쉬운 것으로 판단하였다.